Вы здесь

Криоконсервация клеточных культур млекопитающих с использованием ксенона

Пульвер А. Ю., Целиковский А. В., Пульвер Н. А., Артюхов И. В., Перегудов А. Г.
Материалы Международной заочной научно-практической конференции "Теоретические и практические аспекты современной криобиологии"

В отличие от дрожжей, которые замораживались по примитивному протоколу (см. в данном сборнике “Криоконсервация Saccharomyces…”), для культур клеток млекопитающих мы планировали использовать в основном различные варианты градиентного охлаждения (Thirumala, Goebel, et al. 2009) в наших собственных модификациях. Оно отлично показало себя в нашей лаборатории, давая клеточную выживаемость не менее 85%, а чаще даже более 90% клеток. Для определения криопротекторных свойств ксенона клеточные культуры: CHO-K1 – с предполагаемой хорошей выживаемостью после криоконсервации, и NIH-3T3 (рис. 1) – с посредственной. Единственным осложнением оказалась необычно высокая выживаемость NIH-3T3 после замораживания до криогенных температур, превосходящая паспортную – более 90% клеток, практически ничем не отличающаяся от таковой у CHO-K1.

Рис. 1. Монослой NIH-3T3 (x150, фазовый контраст).

Схема охлаждения была взята следующая: криопробирки с клеточной культурой избранного состава либо при комнатной температуре (в отсутствие диметилсульфоксида (DMSO)), либо на ледяной бане (в случае использования DMSO) в стерильных условиях помещались в барокамеру, та герметизировалась и минуту продувалась либо азотом, либо ксеноном, либо воздухом с добавлением 5% СО2, после чего давление доводилось до запланированного путем добавления ксенона.

Затем барокамера помещалась либо сразу в жидкий азот (“шоковая заморозка”), либо в криотермостат (спиртовую баню) при 4°С (рис. 2) и постепенно охлаждалась (со скоростью 1-1,5°C в минуту) до -80°C. После чего криобарокамера захолаживалась в жидком азоте, помещалась в пенопластовый термоконтейнер, где крышка с нее быстро снималась, на криопробирки навинчивались предварительно захоложенные в жидком азоте крышки, после чего пробирки переносились в криобокс и вслед за тем в криохранилище. Примитивные “дрожжевые” протоколы и “шоковую заморозку” мы использовали только в небольшом количестве случаев для ”контрольных групп”, в которых не предполагалось выживания клеток.

Результаты. Скоростное размораживание на водяной бане при 4°C. Давление ксенона и контроля (азот) пробовались различные – от 2,5 ат и вплоть до 12. Для размораживания вначале мы попробовали согревать криопробирки на водяной бане при 37°C до растворения льда/клатрата. Как оказалось, в экспериментальной группе в препаратах, замороженных с ксеноном без добавления криопротекторов (любого протокола градиентной заморозки и состава культуральной среды), при давлении больше 3 ат во время разморозки имело место сильное пенообразование, а при микроскопии клетки вообще не определялись. Даже просто целых, а тем более, жизнеспособных, клеток не было.

Рис. 2. Охлаждение в криотермостате.

В препаратах, замороженных при 2,5-3 ат, после разморозки отдельные части клеток микроскопически определялись, но живых и даже просто целых на вид все равно не было.

В то же время в препаратах, замороженных с ксеноном в присутствии традиционных криопротекторов (ДМСО, глицерин), несмотря на сильнейшее пенообразование (зачастую выталкивающее более 90% образца из криопробирки) имела место сравнимая с безксеноновым (азот при тех же давлениях и прочих криопротекторах) контролем (60,2±7%) выживаемость клеток при всех опробованных давлениях – в среднем 56,9±27,7%. Из прочих особенностей при микроскопии была замечена склонность к образованию кластеров из нескольких клеток. Такая высокая выживаемость объясняется, судя по всему, способностью криопротекторов подавлять клатратообразование (Cruz-Torres, Romero-Martinez, et al. 2008; Booker, Koh, et al. 2011).

Компьютерное моделирование взаимодействия ксенона с водой

Вышеописанные результаты заставили нас предположить, что разрушение клеток происходит на этапе разморозки, и обратиться за помощью к коллегам для проведения дополнительных исследований по моделированию свойств газогидратов ксенона (рис. 3).

Согласно расчетам (V. Artyukhov, Pulver, et. al. 2014) оказалось, что ксенон начинает образовывать клатраты при концентрации приблизительно 1 молекула на 20 молекул воды, а стабильный клатрат содержит 1 молекулу ксенона приблизительно на 7 молекул воды. В результате при начале внутриклеточного клатратообразования количество растворенного в цитоплазме ксенона начинает стремительно падать, и по градиенту концентрации все новые и новые молекулы ксенона поступают в клетку из внеклеточного пространства, клетке не будет связана в виде кристаллогидрата вся вода. При нагревании, как только клатрат перестает быть стабильным (при атмосферном давлении это –1.6°), из него выделяется ксенон, и, по превышении уровня своей растворимости в цитоплазме – мгновенно переходит в газовую фазу и разрушает клетку (Derwall, Coburn, et al. 2009; Mendes and Gomes, 2003).

Рис. 3. (V. Artyukhov, Pulver, et. al. 2014) Замерзание раствора ксенона. Финальная структура двухфазной системы: 4% mol.Xe/mol.H2O, 268 К, 1 ат.

Впоследствии это подтвердилось в экспериментах с мотылем, который также практически не реагировал на повышенное давление воздуха или азота и даже на быструю декомпрессию. А вот при охлаждении в присутствии ксенона при последующем нагреве появлялось большое количество крупных пузырей, сливающихся между собой в “цистерны” внутри хитиновых сегментов тел личинок. Сами же они теряли гемолимфу, утекавшую в окружающий раствор (рис. 4), и не проявляли двигательную активность, вплоть до отсутствия сердечных сокращений.

На основании вышеописанного мы сделали следующие выводы: чтобы клетки не разрывало, необходимо, во-первых, разрушать клатрат при таком давлении, когда выделяющийся газ может целиком раствориться в жидкости. Во-вторых, после размораживания проводить постепенную декомпрессию, причем во время нее обеспечить как можно меньшую концентрацию ксенона во внеклеточном пространстве, для еще большего облегчения выхода ксенона из клеток без перехода в газовую фазу. В связи с этим был изготовлен дополнительный съемный балластный объем (примерно 150 мл), монтируемый на криобарокамеру во время декомпрессии.

Рис. 4. (V. Artyukhov, Pulver, et. al. 2014) Замерзание раствора ксенона. Финальная структура двухфазной системы: 4% mol.Xe/mol.H2O, 268 К, 1 ат.

Размораживание при 8-10 ат гелия (He) x последующей 30-50 минутной декомпрессией

Для декомпрессионной разморозки был разработан следующий протокол. Нижняя часть криобарокамеры (без крышки) захолаживается в жидком азоте в течение 5-6 минут, после чего вставляется в пенопластовую термоизоляцию и переносится в ламинарный бокс. Криопробирки достаются из емкости с жидким азотом и после откручивания крышек размещаются в ячейках криобарокамеры. Последняя закрывается крышкой, герметизируется и убирается из ламинарного бокса, после чего заполняется гелием до 8-10 ат, ставится в водяную баню при 37°С на 3-4 мин, после чего перемещается в емкость с водой комнатной температуры и выдерживается там либо 20- 30, либо 50 минут, после чего начинается 30- или 50-минутная ручная декомпрессия (подбираемая по скорости выделения пузырьков газа в минуту). При декомпрессии пространство над криопробирками продувалось газом с нулевым содержанием ксенона из балластного объема, а мелкие подвижные молекулы гелия дополнительно облегчали декомпрессию.

В результате, после такой декомпрессии у клеток, замороженных с ксеноном в присутствии традиционных криопротекторов (ДМСО, глицерин) появилась сравнимая с безксеноновым (азот при тех же давлениях) контролем выживаемость клеток при всех опробованных давлениях – в среднем 60±25% (рис. 5). При этом разницы в выживаемости при 8 и 10 ат не обнаружено в пределах статистической погрешности, равно как и при различном времени декомпрессии. Единственное отличие – при более высоком давлении, либо при 30-минутной декомпрессии в криопробирках замечалось бульшее пенообразование, чем при 8 ат или 50 минутах.

Рис. 5. Отсутствие живых клеток (7 ат Xe, градиентное охлаждение).

Рис. 6. Отсутствие живых клеток (7 ат Xe, градиентное охлаждение).

Кстати, примечателен тот факт, что, как и в случае дрожжей, само по себе повышенное давление на выживаемость культур клеток млекопитающих также не влияет.

К сожалению, у клеток, замороженных по градиентным протоколам только с ксеноном, выживаемость все равно оставалась нулевой. Хотя сами клетки получались целыми, оформленными – но мертвыми (рис. 6). Контрольные же эксперименты, к нашему удивлению, дали совершенно другие результаты. Препараты, замороженные по “дрожжевому протоколу” (2 ч. при -20°С, погружение барокамеры в жидкий азот)» с 7 ат ксенона (рис. 7), показали клеточную выживаемость в 2,8±2,3% (от 0,5% до 8,1%). Препараты, замороженные по тому же протоколу с 6 ат R134a – 2,4±0,9% (от 1,6% до 4,4%). А совсем “не подававшие надежд” препараты с разными вариантами ”шоковой заморозки” (максимально быстрое охлаждение от 0°С до -196°С путем погружения барокамеры в жидкий азот) с 7 ат ксенона дали выживаемость соответственно в 10,5±4,4% и 22,5±13,4%.

Рис. 7. 7% выживаемость (7 ат Xe).

Все вышеперечисленное говорит о том, что ксенон, несмотря на опасность разрушения клеток при таянии клатрата, все же обладает криопротекторными свойствами, и применение газовых криопротекторов является потенциально весьма перспективным. Однако требует разработки принципиально новых протоколов заморозки и программной декомпрессии.

Литература

1. Artyukhov, V., A. Pulver, et. al. (2014). “Impact of xenon on the freezing of water: molecular dynamics.” The Journal of Chemical Physics (in press).
2. Booker, R. D., C. A. Koh, et al. (2011). “Xenon hydrate dissociation measurements with model protein systems.” The Journal of Physical Chemistry B 115(34): 10270-10276.
3. Cruz-Torres, A., A. Romero-Martinez, et al. (2008). “Computational study on the antifreeze glycoproteins as inhibitors of clathrate-hydrate formation.” Chemphyschem: a European journal of chemical physics and physical chemistry. 9(11): 1630-5.
4. Derwall, M., M. Coburn, et al. (2009). “Xenon: recent developments and future perspectives.” Minerva anestesiologica 75(1-2): 37-45.
5. Mendes, F. F. and M. E. Gomes (2003). “Xenon: pharmacology and clinical use.” Revista Brasileira de Anestesiologia 53(4): 535-542.
6. Thirumala, S., W. S. Goebel, et al. (2009). “Clinical grade adult stem cell banking.” Organogenesis 5(3): 143-154.

Источник: Теоретические и практические аспекты современной криобиологии Материалы Международной заочной научно-практической конференции (24 марта 2014 г. Россия – Украина). – Сыктывкар, 2014, стр, 226-233

Поделиться